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双氯芬酸对盐酸莫西沙星在大鼠体内的药代动力学作用pdf

发布时间: 2019-07-08? 来源:本站原创 作者:admin

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  温州医学院 硕士学位论文 双氯芬酸对盐酸莫西沙星在大鼠体内的药代动力学影响 姓名:朱加银 申请学位级别:硕士 专业:药理学 指导教师:胡国新 20100501 温州医学院硕:l二学位论文 双氯芬酸对盐酸莫西沙星在大鼠 体内的药代动力学影响 手两要 目的: 建立大鼠血浆中莫西沙星的高效液相色谱分析方法,研究双氯芬酸对莫西沙 星在大鼠体内药代动力学影响。 方法: 1 100 1、建立莫西沙星的高效液相色谱检测法:高效液相色谱仪为Agilent 动进样器、G1315B_二极管阵列检测器、Agilent化学工作站(RevA.10.02.[1757】)。 色谱柱选用ZORBAX Eclipse 下层有机相1.8mL于另一尖底离心玻璃试管中,氮吹仪中吹干。用1009L流动相 复溶,取上清液于自动进样器的样品瓶中,20p,L进样检测。 2、药代动力学试验:健康雄性SD大鼠18只随机分成2组,每组9只,分别 为:单用莫西沙星组(单用组)和双氯芬酸与莫西沙星联合使用组(联用组)。 Statistics 度,用药物与统计软件DrugAnd version2.0(DAS)分析药代动力学参数, 绘制药物浓度一时间曲线,并采用双向单侧t检验、Wilcoxon非参数检验和成组t 检验对两组药代动力学参数进行比较。 仕申 三日木: 1、莫西沙星纯标准品加内标吡啡尼酮、莫西沙星血浆标准品,经HPLC分 析测定得到的色谱图,莫西沙星与内标能完全分离,没有明显的内生杂质峰干扰。 莫西沙星的保留时间为3.6min,内标吡啡尼酮的保留时间为6.3min。莫西沙星浓 度在0.05-1 O.5、5.0 , 温州医学院硕士学位论文 94.106+3.963%。血浆样品在室温放置和冰冻保存的条件下,均有很好的稳定性。 本方法具有较高的专属性。 结论: ; 1、本研究采用的高效液相色谱方法快速、简便、灵敏、准确可靠,适用于 血浆莫西沙星测定及其临床药代动力学研究。 2、双氯芬酸和莫西沙星联合用于大鼠时,双氯芬酸使莫西沙星的AUC和 Cm双减小,I瞄床上应注意两药联用时的给药量。 关键词: 莫西沙星;双氯芬酸;大鼠血浆;药代动力学;高效液相色谱法 塑型堕兰堕堡主兰竺垒.文 一 一 Moxifloxacin Diclofenacon Effectsof forRats Pharmacokinetic ABSTRACT oBJEC。l’lVE: methodforthe a chromatography To liquid highperformance develop ofDiclofenacon inrat theeffects ofMoxifloxacin study dete肌ination plasma.To Moxifloxacin forrats. pharrnacokinetic METHODS: of fordetection chromatography 1.Toestablish liquid highperformance were with equippedAgilent chromatography liquid Moxifloxacin:highperformance G1311A on—line 1100seriesm,include quadr.pump,G1322A automatic diode sampleinjector;G1315B coIumn incubator,G1313A temperature A.1 撕ay workstation(Rev0.02.[1757】).ZORBAX detector,Agilent,chemical as 1 used XDB.C8(4.6x50mm,59m,Agilent,USA)was Eclipse water:0.1%Trifuoroacetic was colur加.mobile phase waveWas was ratewas 30C;detection V,、,/V).flow 1.0ml/min;columntemperature into10mL tube,added5099/mL 296眦.Rat wastaken sample plasma200弘L acid was beneO.5%Trifuoroacetic209Ladded,then Pirfenidone misce 209L,after at then 10min swirledlmin.And Wasaddedand centrifuged 2.0mL Dichlorometl姗e toanother centrifuge that Wastransferred graduated phase 4000rpm,afterorganic 1 mobileClear liquid by00扯L phase supernatant tube,hyedbynitrogen.Re.dissolved fordetection· boRleof introduction 、懈k出eninto sampleinjector,209L sample into2 Ratswere divided groups(n59 randomly 2.EiglateenSprague.Dawley and with withoutDiclofenac DM,Moxifloxacin M,Moxifloxacin group each):gmup Moxifloxacin grouop were orally;In Diclofenac.InM,rats given40mg/kg grouop Moxifloxacin Diclofenacand orally·Blood were 40mg/kg DM.rats 25mg/kg given andat fromthetailveinbefore weretaken s锄ples concentratlon of Moxifloxacin bY after fordetermination 6,12,24h gavage plasma drawn.The was parameters curve blood level.time pharmacokinetic HPLC.The drug zerotolastdata curvefromtime p0Int areaunderthe two includedthe of groups to fromtimezero underthecurve area (AUC(O.t)),the .6- 温州医学院硕二l:学位论文 maximum to half concentration(Cmax),timeCmax(Tmax),biologicallife(tl/2)and clearance(Clz/F)werecalculatedAnd byDrug Statisticssoftversion2.0.Thenthe two were with to groupscomparablerespectpharrnacokinetic were bilateralhalf was l/2 comparedby t-text;Tmax Wilcoxon—test;t comparedby andCIz/Fwere are t-test.Valuesmean4-SD. by compared RES哪S: 1.MoxifloxacinandinternalstandardCanbe underthis separatedcompletely and condition.Moxifloxaeininternaldidnotinterfered、析th substancein endogeny timeofMoxifloxacinwas time of chromatogram.Retention 3.6min,Retention internalstandardwas Was 6.3min.Excellentlinear obtainedfromthe relationship of0.05to1 detectablelimitwasO.05 range Ogg/mL(r=O.9996),Lowest gg/mL. of at in Moxifloxacin rat showRSD Intra-dayprecisions 0.1、0.5、5.099/mLplasma were5.760%、4.818%and of were 4.063%,respectively.RSDInter-daypreeisions inrat 6.019%、4.341%and recoveriesofMoxifloxacin 3.232%,respectively.Relative at plasma0.1、0.5、5.O!ag/mL recoveriesofMoxifloxacininrat j01.4184-4.816%,respectively.Absolute plasma were88.1064-6.080%、90.5674-4.443%and94.1 in orinfreezed bothshow the room condition plasma temperature goodstability.So methodhas goodspecificity. Moxifloxacinin 2.Cmax(6.9654-1.05299/mLversus4.445士0.96699/mL)of Mwas thanthatin higher DM,accompaniedbysignificant group significantly group increaseof versus AUC(O—t)(34.3504-9.590pg·mL·h versus30.83 1士11.887ng。mL。h)ingroup AUC(0-oo)(41.241土12.220pg·mL。h side side differencesbetweentwo in P0.05,lowP0.05).No groupsTmax, DM(high t1/2andClz厂Fwerefound(PO.05). CONCLUSION: todeterminethe 1.Themethodis andcallbeused simple,rapid,accurate inrat andfor oftheir Moxifloxacinconcentration plasma study pharmacokinetics. 2.WhenDiclofenacandMoxifloxacinare·bothusedinrats.Diclofenac of two fireusedin decreasesAUCandCmaxMoxifloxacin.Whenboth drugs clinical total shouldberestricted. application,thedosage KEYⅥDRDS: Moxifloxacin;Diclofenac;rat performance liquidchromatography .7. 温州医学院顾。卜学位论文 缩词简表 缩写 英文 中文 area AUC undercurve 曲线下面积 AUC areaundercurveof0一ttime O-t时间曲线下面积 (u‘t) areaundercurveof time O-ooH寸间曲线下面积 AUC((O-∞) O—infinity C concentration 峰浓度 max peak T time 峰时间 ofpeak tl彪 halflife 半衰期 Cl加 clearance 清除率 mLC hi曲performanceliquid 高效液相色谱法 chromatography RSD coe艏cientofvariation 变异系数 LowerLimitof 定量下限 LLOQ quantitation M Moxifloxacin 莫西沙星 D Diclofe:nacSodium 双氯芬酸钠 .3. 温州医学院硕士学位论文 前言 盐酸莫西沙星(Moxifloxacin S).2,8.重氮.二环【4.3.O】壬.8.基)一6一氟一8.甲氧.1,4一二氢.4.氧一3.喹啉羧酸盐酸盐, 分子式:C2lH24FN304·HCI,分子量:437.9。 莫西沙星为新一代氟喹诺酮类抗菌药物,是德国拜耳公司开发的具有广谱和 抗菌活性的第四代8.甲氧基喹诺酮类抗菌刻11。该药抗菌机制为通过抑制II、 Ⅳ拓扑异构酶的作用,干扰细菌的DNA复制。它既保持了早期喹诺酮药物对革 兰阴性菌良好的抗菌活性,又增强了对革兰阳性菌、厌氧菌、抗酸菌及非典型微 生物如支原体、衣原体和军团菌的抗菌活性【2,3】。常用于患有上呼吸道和下呼吸 道感染的成人(≥18岁),如急性窦炎、慢性支气管炎急性发作、社区获得性肺 炎,以及皮肤和软组织感染。 莫西沙星口服后可以很快被几乎完全吸收。绝对生物利用度总计约91%。达 学显示出呈线天内达稳态。给予莫西沙星同时进食能稍延长达峰时间 约2d,时并减少峰浓度约16%,吸收范围不变。由于AUC/MIC(药时曲线下面积与 最小抑菌浓度的比值)主要是预测喹诺酮的抗菌效果,该影响与I临床无关。因此, 莫西沙星给药不受进食影响。莫西沙星可以很快分布到血管外间隙,该药的药时 下列组织中达到高浓度:如肺(肺泡液,肺泡巨噬细胞,支气管组织),窦(筛窦, 上颌窦,鼻息肉)和炎症损伤(斑蝥疱疹液),其药物浓度超过血药浓度。莫西沙星 经过生物转化后通过肾脏和胆汁/粪便以原形和硫化物(M1)和葡萄糖醛酸盐(M2) 的形式排出。M1和M2只是在人体内的相关代谢产物,均无微生物活性。莫西沙 星从血浆和唾液中被排出的平均半衰期为12d时。口服400mg药物后的平均总体 表现清除率为179.246ml/min。肾清除率为24.53ml/min。 双氯芬酸钠(DiclofenacSodium)为邻氨基苯甲酸类非甾体抗炎药,具有较强 的抗风湿、消炎、镇痛和退热作用,目前已广泛应用于临床[4.7】。其药理作用是 通过抑制脂氧化酶和环氧化酶,尤其通过抑制环氧化酶途径而导致抑制花生四 烯酸而起效的。· 某些实验表明双氯芬酸主要通过影响一些氟喹诺酮类抗菌药物的肾清除率 而显著改变氟喹诺酮类抗菌药物的药动学行为【8】。位于大鼠肾脏的转运体包括有 anion 机阴离子转运体(organic cation transporters,OCTs)、肽类转运体(peptide 阴离子转运体介导多种内源性和外源性有机阴离子包括多种药物的肾脏分泌和 重吸收,其中OATl和OAT3主要表达在近端肾小管上皮细胞基底侧膜,在介导有 温州医学院硕士学位论文 机阴离子进入肾小管上皮细胞中发挥重要作用。有机阳离子转运体介导了一些药 物、毒物和内源性化合物等一系列有机阳离子的转运。OCTs家族的第一成员 OCTl在许多外源性药物的吸收、分布和排泄中发挥着重要的作用。而双氯芬酸 以抑制有机阳离子转运体,女IOCTl和OCT2介导的摄取…11。 双氯芬酸作为一种非甾体抗炎药应用于临床,而莫西沙星则是一种人工合成 的氟喹诺酮类抗菌药。鉴于这两个药物的药理学特性,临床上用于治疗呼吸道感 染时两药合用完全可能。但有报道【8】,双氯芬酸与一些氟喹诺酮类抗菌药物合用 时可产生体内相互作用,严重影响了药物的疗效,并且增加了不良反应的发生率。 因此,考察双氯芬酸对莫西沙星的药代动力学影响就更有临床意义。 本课题首先建立与评价高效液相色谱法检测大鼠血浆莫西沙星浓度的方法, 在此基础上研究双氯芬酸对莫西沙星在大鼠体内的药代动力学影响,以期为临床 用药提供药代动力学依据与质量保证。 温州医学院顾l:学位论文 参考文献 【l】孙忠实.莫西沙星【J】.中国新药杂志2000,9(10):7221 【2】蒋丽娟,蔡冬梅,王涤非,等.莫西沙星治疗老年慢性阻塞性肺疾病急性下呼吸道感染临床 1l 评价[J】.中国抗感染化疗杂志2005,5(5):29 R.Areviewoftheclinical 【3】Wise of new moxifloxacin,a pharmacology its relationto 8-methoxyquin“Lone,andpotentiI.tL InveSt therapeuticefficacy[J].Clin Drug 1999,17(5):365 【4】谢碧贤.高热患者肌注双氯芬酸钠降温后的护理[J】.国际医药卫生导报 2007,13(8):97-98 【5】王春丽,何春妮.双氯芬酸钠缓释片用丁人:1:流产.1卜痂的观察【J】.中国医院约学杂忠 24 2004,24(2):1 【6】周凤,刘春民,韩冰,等.儿童斜视术后应用典必舒和双氯芬酸钠眼药水的疗效观察【J】.国 际眼科杂志2007,7(1):212.214 【7】顾悦超,张勇.双氯芬酸钠联合吗啡控释片治疗转移性骨肿瘤疼痛[J】.中国癌症杂志 2004,1 4(1):78-79. 【8】庞晓雁,谢林,许潇,等.非甾体抗炎药对安妥沙星在大鼠体内药动学的影响【J】.中国新药 杂志2007,16(8):600.603 of studies 【9】MizunoN,NiwaT,YotsumotoY,et on a1.Impactdrugtransporter drugdiscovery and Rev 1 development[J].Pharmacol2003,55(3):425—46 a1.Interactionofhuman S,TakedaM,NoshiroR,et anion 【10】Khamdang organictransporters andhuman cation withnonsteroidal organictransporters anti—inflammatory Ther Exp 2002,303(2):534—542 a1.Rat anion 【ll】WadaS,TsudaM,SekineT,et 1) multispecificorganictransporterl(rOAT otherantiviral nucleoside Pharmacol transportszidovudine,acyclovir,and analogs[J].J Exp 。 Ther 2000,294(3):844.852. -10. 温州医学院硕士学位论文 第一部分高效液相色谱法检测血浆莫西沙星的 方法建立与评价 莫西沙星系新型长效广谱抗菌药,它在保持传统喹诺酮类药物的良好抗革兰 阴性菌活性的基础上,抗革兰阳性菌的活性得到增强,对社区获得性呼吸道病原体 均具有活性,包括常见的肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌和较少见的金 葡球菌与肺炎克雷伯杆菌以及呼吸道的非典型病原体如支原体、衣原体与军团菌, 临床地位较为重要【11。目前已有文献报道主要采用HPLC。荧光法【2-31、LC.质谱 法【4】、LC.紫外法【5】等方法检测血中莫西沙星的浓度。此本实验以这些方法为 基础并加以适当改进,建立用二氯甲烷为提取液,血浆直接进行液.液萃取,浓缩后 直接进样测定的高效液相色谱检测方法,为莫西沙星的药代动力学研究奠定基 础。 第一节材料与方法 1.仪器 1 高效液相色谱仪为Agilent 100系列(Agilent,USA) G1311A四元泵 G1322A在线B二极管阵列检测器 A.1 7571) Agilent化学工作站(Rev0.02.[1 涡旋混合器(XK96一B,姜堰市新康医疗器械有限公司) 氮吹仪(D10型,杭州蓝焰科技有限公司) 重蒸水仪(1810.B型,江苏金坛市科析仪器有限公司) 高速离心机(TGL一16G,上海安亭科学仪器厂); 石英亚沸高纯水蒸馏器(SYZ.550,江苏金坛市丹阳门石英玻璃厂)。 2.试剂和药品 甲醇(一级色谱纯,天津市四友精细化学品有限公司,091021.16) 乙腈(一级色谱纯,天津市四友精细化学品有限公司,091010—16) 温州医学院硕士学位论文 三氟乙酸(色谱纯,美国天地试剂公司,FS0630—020) 二氯甲烷(一级色谱纯,天津市四友精细化学品有限公司,080902101) 1) 莫西沙星标准品(德国拜耳公司,批号:C064221 吡啡尼酮标准品(含量98%,中国药品生物制品检定所) 实验用水均为重蒸水(本实验室自制) 3.溶液的配制 3.1盐酸莫西沙星标准品溶液 用灵敏度为0.1mg的电子分析天平准确称取盐酸莫西沙星标准品10mg于 储备液。 2.51xg/mL、1pg/mL、0.51xg/mL的标准应用液(临用时稀释): 3.2吡啡尼酮标准品溶液的配制 吡啡尼酮标准品于干燥器干燥至恒重。用灵敏度为O.1mg的电子天平准确称 取吡啡尼酮标准品10mg,用甲醇溶解,于10mL容量瓶内定容,最终浓度为 tmg/mL。然后用甲醇稀释成浓度50}tg/mL的标准应用液(内标应用液)。 4.色谱条件 色谱柱:ZORBAX Eclipse 流动相: 水:O.1%三氟乙酸:乙腈=40:35:25(VⅣ~) 流速:1.0ml/min 柱温:30℃ 检测波长:296nm 检测灵敏度:0.1mAU。 5.血浆样品的处理方法 吡啡尼酮内标工作液20此,混匀后加入O.5%三氟乙酸溶液209L酸化血浆。再加 相复溶,取上清液于自动进样器的样品瓶中,设定20pL进样检测。 第二节试验结果 1.方法的专属性 温州医学院硕J:学位论文 盐酸莫西沙星纯标准品、空白血浆、莫西沙星血浆标准以及大鼠血浆样品, 经HPLC分析测定得到的色谱图见图1.1。由图可见在本实验条件下,莫西沙星与 内标毗啡尼酮能完全分离,没有明显的内生杂质峰干扰。莫西沙星的保留时间为 3.6min,内标吡啡尼酮的保留时间为6.3min。可见本方法具有较高的专属性。 2009-11·30 E.Sig=296.16 13-02-21、006—0301.D) Ref=360.100(20091130、DEFl一LC A ’Ir.r一一+1一r一1 2一 .. 1年 ”In B 温州医学院硕士学位论文 C D 图1.1盐酸莫西沙星的高效液相色谱图 (A:空白血浆,B:标准品,C:血浆标准+内标,D:样本+内标,1.莫西沙星,2. 内标) HPLC ofMoxifloxacin Fig.1-1 ChromatogramsHydroehloride (A:blank standard+internal plasma,B:purestandard,C:plasma standard,D: standard,1-Moxifloxacin,2-internal sample+internal standard) .14. 温州医学院硕J:学位论文 2.血浆标准曲线只lOmL尖底离心玻璃试管,依次加入不同浓度不同体积的莫西沙星标准 2.5、5.0、10.O“g/mL的血浆样品,再按上述处理方法处理后,测定莫西沙星峰面 积舢、内标峰面积As,纵坐标Y取Ai/As的比值,横坐标x取所对应各点浓度C值, 绘制标准曲线。经最小二乘法线性回归,得莫西沙星的血浆标准曲线和图1.2。 表1.1奠西沙星血浆标准曲线结果 Resultsofthecurveof standardofMoxifloxacin Table.1—1 plasma C(I.tg·mL’1) Ai(mAU·S)As(EAU·S) Ai/As 0.05 6.7 173.6 O.038 0.1 lO.7 170.8 0.062 O.25 25.8 159.7 O.161 0.5 51.7 162.4 O.318 1.0 115.7 166.8 0.693 2.5 260.2 154.8 1.680 5.O 609.5 165.3 3.687 10.0 1265.7 174.9 7.236 图l-2.莫西沙星血浆标准曲线 curveofMoxifloxaeinin Standard Fig.1—2 plasma 3.检测下限 按信 bL2:1,可取标准曲线Itg/mL为最低可测血药浓度。 .15. 温州医学院顾L学位论文 4.精密度试验 4.1日内精密度试验 取空白血浆15份,每份200pL,各加不同量的盐酸莫西沙星标准工作溶液, 份,再按上述血浆样品处理方法处理。各浓度分别在同一同内测定,计算R内精 密度。上述三种浓度测定结果的RSD均小于15%(结果见表1.2)。 表l一2血浆莫西沙星的日内精密度(n--5,mean4-SD) of in Table.1-2 Moxifloxacinhuman 4-SD) Intra—dayprecisions plasma(n=5,mean 4.2日间精密度试验 取空白血浆15份,每份200pL,各加不同量的盐酸莫西沙星标准工作溶液, 份,再按上述血浆样品处理方法处理,在连续不同日内重复测定5次,计算同间 精密度。上述三种浓度测定结果的RSD均在15%范围内(结果见表1.3)。 表1-3血浆莫西沙星的日间精密度(n-5,mean士SO) Table.1-3 ofMoxifloxacininhuman Inter—dayprecisions plasma(n=5,mean4-so) 5.回收率试验 5.1相对回收率试验 取空白血浆15份,每份200pL,各加不同量的盐酸莫西沙星标准工作溶液, 份,再按上述血浆样品处理方法处理后测定,依据标准曲线计算检测量。以检测 温州医学院硕士学位论文 量与加入量的比值计算相对回收率。上述三种浓度测定结果均在85~115%范围 内,平均相对回收率为102.232_-1:5.603%。(结果见表1—4) 表1-4血浆莫西沙星的相对回收率(n-5,mean4-sD) Table.1-4RelativerecoveriesofMoxifloxaein inhuman plasma(n=5,mean-1-SD) ’ 5.2绝对回收率试验 取空白血浆15份,每份200¨L,各加不同量的盐酸莫西沙星标准工作溶液, 份,再按上述血浆样品处理方法处理后测定,计算莫西沙星的峰面积。另取尖底 离心玻璃试管15支,5个一组;每组加入与配制血浆标准品溶液相同的莫西沙星 标准品溶液,挥干后用流动相100“L复溶,20止进样检测;记录不同浓度莫西沙 星的峰面积,为该浓度的纯标准品的峰面积。计算血浆标准的峰面积与纯标的峰 面积的比值,即为绝对回收率,平均绝对回收率为90.926士5.214%。(结果见表 1-5)。 表.1-5血浆莫西沙星的绝对回收率(n=5,mean4-SD) Table.1—5AbsoluterecoveriesofMoxifloxacininhuman plasma(n=5,mean士SD) 6.样品稳定性 6.1处理后的血浆样品在自动进样器内的稳定性 本试验所采用的高效液相色谱仪的进样器为全自动进样器,最大样品数有 100个,第一个样品与最后一个样品的检测时间有较长的时间间隔,故应考察处 理后的血浆样品在迸样器的样品瓶内放置的稳定性。配置低、中、高三个浓度的 温州医学院硕士学位论文 莫西沙星血浆标准溶液,按样品处理方法处理后,分别检测在进样器内放置0,3, 6,12小时的浓度,考察其稳定性(结果见表1.6)。 6.2冻融条件下血浆样品的稳定性 配制低、中、高三个浓度的莫西沙星血浆标准对照溶液,每个浓度lmL:放 ℃冰箱中,2h后解冻,各取2001.tL/fll浆样品检测。重复2次,考察其稳定性。结 果显示冻融条件对血浆样品的检测结果没有明显的影响。 (结果见表1-6) 6.3室温放置和冰冻保存血浆样品的稳定性 配制低、中、高三个浓度的莫西沙星血浆标准对照溶液,每个浓度6份,其 中3份在室温下放置0、3、6、12dx时后再经血浆样品处理方法处理后进样检测, 记录结果。另Pl-3份分别在一40。C冰箱冷冻保存1周、2周和4周后,再经血浆样 ’ 品处理方法处理后进样检测,记录结果。 结果显示:莫西沙星标准血浆样品在室温放置12小时以内测定,结果没有 明显变化;在一40*(2冰箱冰冻条件下冷藏一个月内测定,结果同样没有明显变化。 说明血浆样品在室温放置和冰冻保存的条件下,均有很好的稳定性(结果见表 1.6)。 7.质量控制 本研究采用内标法检测,内标的量直接影响检测结果的准确性,故在血浆样 品的处理过程中,每次所加入的内标的量一定要准确。 配制足够量莫西沙星血浆标准品溶液作为质控样品,分别在方法学考察过程 中以及血浆样品检测前、中、后进行测定,来检验标准曲线并保证检测结果的准 确。当日处理的血浆样品,必须当日检测完毕。 为了防止因流动相或其他原因造成的保留时间的偏差,每天检测前要用纯标 准品进行定性分析。 温州医学院硕士学位论文 第三节讨论与结论 1.讨论 本试验建立了以毗啡尼酮为内标,二氯甲烷为提取液,血浆直接进行液一液 萃取,浓缩后直接进样测定的反相高效液相色谱检测血浆莫西沙星的方法,具有 操作简便、测定速度快、试剂价廉等优点,便于推广使用。 1.1色谱柱的选择 ZORBAX XDB色谱柱(C18、C8、苯基和氰基)提供四种键 hgilent Eclipse 合固定相,用于方法开发优化。这些色谱柱可在宽pH范围(pH2—9)内提供良好 XDB 的峰形,实现了使用一系列的色谱柱进行方法开发的卓越灵活性。Eolipse 色谱柱可以用于低pH(2-3)的初始方法开发,且可提供所有类型化合物的高分 离度和出色峰形。同样的色谱柱还可用于中等pH(6-8)范围的方法开发。在中 等PH范围,残留的硅醇基更加活跃,引起拖尾的反应更多。为了克服这些相互作 用,EclipseXDB采用专利的工艺进行超密键合和双封端,以覆盖尽可能多的活 性硅羟基。另外,本试验过程中,曾经接上XDB-C8保护住,结果柱压增高,而且 有肩峰,只好拆除保护柱。因此选择ZORBAXEclipseXDB-C8色谱柱为分析柱, 其分离效果及峰形均非常理想。 1.2流动相的选择 文献报道有以乙腈与0.25mol/L磷酸钠溶液(15:85,VⅣ)为流动相16j,有以乙 (99.9:0.1.V~)为流动相【5】。本研究通过调整流动相构成成分及体积比,考察 寻找合适的流动相。结果见表1.7。 温州医学院硕士学位论文 表1.7流动相构成成分及其体积比 The Table.1—7constitutionofmobile andratiosoftheir phases volume 通过实验发现:①流动相中使用乙腈比甲醇效果好。②有机相比例减少对峰 形影响大,峰形会变宽变矮,保留时间会增大。③磷酸盐缓冲液中加入0.3%三乙 胺没有改变峰面积。④流动相使用较低PH值的三氟乙酸溶液和乙腈时,能够获 得理想的色谱峰;而流动相使用其它成分时,峰形很差,出现双峰、拖尾峰,甚 至保留时间也不稳定。最终确定流动相为水:O.1%三氟乙酸:乙腈--40:35: 25(VⅣⅣ),在此条件下,获得了理想的色谱峰。 1。3柱温的选择 本试验柱温曾分别选择20℃,25℃,35℃,结果发现升高柱温会使峰形变差, 保留时间增大。最终确定30℃柱温时,分离效果最好。 1.4检测波长的选择 本试验曾参考文献【8~,采用241nm的检测波长,发现效果不理想。使JIj--极 管阵列检测器(DAD)进行扫描后,发现莫西沙星的最大吸收波长不是241nm, 温州医学院硕士学位论文 而是296nm。因而选择296nm作为检测波长,能够较好的满足试验需要,与相关 『10.241 。 文献相似‘ 1.5内标物的选择 血浆样品的检测过程较为复杂,偶然误差和系统误差较多,为了提高检测重 现性,减少误差,本试验采用内标法。 内标物一般应满足以下几点:①应是该试样中不存在的纯物质;②必须完全 溶于试样中,并与试样中各组分的色谱峰能完全分离;③加入内标物的量应接近 于被测组分;④色谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近,或在几个被测 组分色谱峰中间。 本试验曾分别选用左氧氟沙星、卡马西平、环丙沙星、氧氟沙星、氨茶碱、 地塞米松、吡啡尼酮、阿司匹林等八种物质为内标,这八种内标物的保留时间见 表卜8。从表中,可以发现左氧氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、氨茶碱的保留时 间在2min左右,而血样中的杂质的保留时间也在2min左右,这样就会影响到内标 物的准确性;卡马西平与阿司匹林没有出峰,原因可能是样品处理方法或者色谱 条件对这两种内标物影响很大,以致没有出峰;地塞米松的保留时间则在5.4min, 虽然保留时间比较理想,但是它的峰面积相对来说却很小,也不适宜作为内标物。 表1_8八种内标物的保留时间 Table.1—8Theretentiontimesofthe internalstandards eight 本实验所用的内标为毗啡尼酮,其化学性质比较稳定,冷藏半年和自然存放 2个月,含量几乎没有变化。它与莫西沙星一样,在296nm范围内均有较好的紫外 吸收,在较广泛的流动相范围内,均能获得较对称的峰形。实验证明吡啡尼酮在 本试验色谱条件下与莫西沙星的保留时间均在8min以内,分离完全,峰形良好, 理论塔板数高,与血浆中其他内源性物质互不干扰,试验表明其萃取回收率与莫 西沙星相近,是较为合适的内标物。 1.6样品处理方法的选择 高效液相色谱法检测样品的处理方法主要有萃取法和沉淀法‘。。 用高氯酸等强酸沉淀法处理样品与有机溶剂萃取法相比,常带入大量杂质, 对所测样品干扰大,影响色谱柱寿命,且蛋白沉淀过程中样品被稀释,这对检测 方法的灵敏度有进一步的要求。本试验对血浆样品的处理条件进行了较长时间的 温州医学院硕士学位论文 优化,尝试过用70%高氯酸沉淀法处理样品,发现有比较明显的杂峰出现;尝试 过以10%三氯乙酸沉淀法处理样品,发现有杂峰出现;也尝试过以血样与乙腈体 积比分别为l:1.5与1:2的乙腈沉淀法处理样品,发现峰形差,有双峰现象。故 采用萃取法处理样本。 目前文献报道的以液一液萃取法处理莫西沙星血浆样品的有三氯甲烷。异丙 醇‘。、乙酸乙酯~等,但本试验室重复这些方法时发现莫西沙星的回收率都不高。 原因可能是莫西沙星呈酸性,而且见光容易分解,在空气中也不稳定。因此本试 验采取0.5%的三氟乙酸来酸化血浆样品,再通过二氯甲烷液.液萃取的方法来提 高莫西沙星的回收率。在选择三氟乙酸浓度的过程中,尝试过以浓度分别为1%, O.8%,0.5%的三氟乙酸来酸化,结果发现以浓度为0.5%的三氟乙酸效果最好。 2.结论 本试验采用的高效液相色谱法检测血浆莫西沙星浓度,专属性高,相对回收 率均在85115%范围内,绝对回收率大于75%;日内和日间精密度RSD均小于 10%,适合莫西沙星的药代动力学研究。本研究建立的血浆莫西沙星检测的HPLC 方法,操作简单,分离完全,结果可靠,回收率高,线性范围宽,成本较低廉; 检测下限0.051.tg/mL,显著提高了HPLC检测的灵敏度;可满足莫西沙星药代动力 学试验的血药浓度检测的要求。 温州医学院硕士学位论文 第二部分双氯芬酸对盐酸莫西沙星在大鼠体内的 药动学影响 本部分拟利用第一部分建立的高效液相色谱法检测血浆中莫西沙星浓度的 方法,进行双氯芬酸对盐酸莫西沙星在大鼠体内的药代动力学影响进行研究。 第一节材料与方法 1.实验对象 许可证编号:SCXK(浙)2005.0019。 2.仪器与药品 ’ 高效液相色谱仪为Agilent 医药保健股份公司生产。双氯芬酸钠肠溶片,规格:25rag/片,批号:0908032, 四川蜀中制药有限公司生产。 3.给药方法 18只大鼠随机分成2组,每组9只,实验前大鼠禁食12h,不禁水。一组为单 用莫西沙星组(单用组,groupM),灌胃给药莫西沙星40mg/kg;另一组为双氯芬 酸与莫西沙星联合用药组(联用组,groupDM),灌胃给药双氯芬酸25mg/kg和莫 西沙星40mg/kg。给药后,立即将大鼠放回笼内,禁食但可以自由饮水。 4.血浆样品的采集 离心10min,分离血浆,.40。C冰冻保存至测定。按第一部分建立的反相高效液相 色谱法分析各点血药浓度。 5.血药浓度测定方法 采用ZORBAXXDB—C8(4.6x Eclipse 日内、日间精密度RSD均小于15%。 温州医学院硕士学位论文 第二节数据分析方法 1.药代动力学参数估算 对采集的样本进行血药浓度的测定,试验结果采用中国药理学会数学药理专 业委员会编写的DAS软件进行数据处理,绘制药物浓度一时问曲线非房室模型的统计矩方法 吸收总量用血药浓度一时间曲线下面积,即AUC表示 血药峰值浓度,用Cm戕表示 达峰时间,即药物达到血药峰值时间,用Tm缸表示 血药浓度一时间曲线末端直线部分斜率求得。 ; 其中Cm戤、Tm觚为实测值,AUC按梯形法计算求得, 药物浓度.时间曲线下面积(AUC)分别用下列公式(1)、(2)计算 ≠f一≠f一1(c,+q,) ,彳%¨)=∑2 ㈩ ≠f一于f一1 彳%哳)=∑ 2 ● 式中k可从末端相对数浓度一时间曲线回归求算,t代表血药浓度观察至某 一个时间。 清除率是指单位时间内多少表观分布容积内的药物被清除掉。总清除率Cl 等于总消除速率常数dx/dt对全血或血浆药物浓度c的比值。对于非静脉给药 FD Cl= 么比’ (3) 2.2统计分析 2.2.1双向单倾,lJt检验 对Cm戤和AUC(o-1m经对数转换后采用双单侧t检验。 检验假设: 5 无效假设HolIT.rlRlnrl或rlT.rlR≥lnr2 各选假设Hl: lnrlnRlnr2 T.n 其中rlT和nR分别为联用组莫西沙星和单用组莫西沙星的参数对数均值,取 温州医学院硕士学位论文 王=一 T一1nr2。(r/T一77R) 二 z (5) 匕一—Si函2/万1/船 (5) ×( 其中,sTb样本误差均方的平方根,来自方差分析。T。、T2服从自由度为V T2tl-a(v)同时成立,则拒绝Ho,接受生物等效性假设Hl。 2.2.2非参数秩和检验 对Tm觚采用WilcoxoniJil符秩和检验,Tm。。用实测值。 。 用Wilcoxon力ll符秩和检验法区分不同处理所得数据时,差值为零的对子不提 供信息,检验时这些数据被弃掉。将两组Tm觚差值排序后,在序号上加上差值符 号,就形成一系列的加符秩。将秩中同号者求得秩和,将秩和中绝对值较小者与 a=O.05时样本容量n下临界值相比,当这个秩和小于或等于临界值时即有显著性 差异。反之,则差异无显著性。 2.2.3成组t检验 其他参数进行成组t检验,a=0.05。 第三节试验结果 1.色谱图 莫西沙星血浆样品经第一部分建立的HPLC方法检测,莫西沙星与内标吡啡 尼酮出峰干净利落,峰形良好,分离完全,无杂质峰干扰,莫西沙星的保留时间 为3.6min,内标的保留时间为6.3min,见图2.1。。 E·si92296·16 2。。9—11·3。13—41—38、。1叫D4。1·。) }吾。A。1 R_36。·1。。‘2。。9113。、1)EFl一uc 1一■~丁—一1一一1。…——‘l ————42——一14一…一…一; 图2-1莫西沙星的高效液相色谱图(血浆样本) HPLC of Fig.2-1 Chromatograms Moxifloxacin(plasmasample) 2.血药浓度一时问数据 18只健康雄性SD大鼠随机分成2组,一组灌胃给药莫西沙星40m∥k;另一 法测得不同时间的莫西沙星血浆药物浓度.时间数据见表2—1、表2.2。 ———————————————————————————————————』型型堕堡主堂垡鲨壅 表2-1单用组大鼠血浆莫西沙星浓度(ttg/mL) O 0 0 O 0 0 O 0 0 O 0 O 0.083 1.489 2.768 2.040 1.539 2.31l 2.043 1.197 1.615 2.932 1.993 0.594 O.25 3.002 4.920 2.525 3.123 3.635 6.325 1.927 2.548 5.485 3.721 1.509 O.5 5.009 6.637 3.551 5.283 4.97l 8.346 3.758 3.774 6.317 5.294 1.583 O.75 6.930 7.225 3.440 5.811 6.614 5.657 5.061 4.584 6.105 5.714 1.204 1.O 7.01l 6.129 7.103 6.212 7.072 3.694 2.838 5.139 8.240 5.938 1.749 1.25 6.660 4.927 7.45l 5.580 6.625 2.515 2.099 6.064 6.649 5.397 1.896 1.5 4.889 4.235 4.792 3.647 5.942 2.332 1.886 5.789 3.334 4.094 1.422 3 2.37l 3.093 2.778 1.588 4.186 1.976 1.336 ”2.397 3.156 2.542 0.878 6 1.572 1.599 1.434 O.638 2.923 1.027 1.187 1.652 2.726 1.640 0.746 12 1.176 1.334 0.348 0.199 1.45l 1.354 0.802 0.689 1.099 0.939 0.454 24 0.713 0.690 O.168 0.147 0.072 0.626 0.621 0.434 0.425 0.433 0.250 27 ————————————————————————二———————————』量坐垦型主堂垡笙奎 一.

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